北京市肺炭疽實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)方案（試行）
一、樣本前處理
（一）對(duì)于放在密封塑料管中的拭子樣本，加入1mL無(wú)菌生理鹽水，充分振蕩，放置5-10分鐘，取浸出液進(jìn)行檢測(cè)；
（二）對(duì)于痰液，加入等體積痰消化液，混勻后放置5-10分鐘，取上清液進(jìn)行檢測(cè)；
（三）對(duì)于糞便和嘔吐物，加入等體積無(wú)菌生理鹽水，混勻后取上清進(jìn)行檢測(cè)；
（四）對(duì)于土壤、草料、皮毛等外環(huán)境樣本，加入適量無(wú)菌生理鹽水漂洗，取上清液進(jìn)行檢測(cè)；培養(yǎng)前在65℃加熱25-30分鐘殺死雜菌；
二、樣本檢測(cè)方法
（一）直接鏡檢
取經(jīng)過預(yù)處理的樣本、液體樣本（如腦脊液、血液）少量，直接涂片，革蘭氏染色后在100倍油鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)鏈狀排列的革蘭氏染色陽(yáng)性大桿菌、兩端平齊、芽胞位于細(xì)胞中間位置時(shí)，判斷為炭疽芽胞桿菌直接鏡檢陽(yáng)性。
（二）抗原膠體金快速檢測(cè)
取炭疽芽胞桿菌抗原膠體金檢測(cè)試劑條，在樣本孔中加入經(jīng)過預(yù)處理的樣本、液體樣本（如腦脊液、全血）50 μＬ，質(zhì)控帶顯色后1分鐘內(nèi)觀察。質(zhì)控帶和樣本帶同時(shí)顯色判斷為陽(yáng)性，單一質(zhì)控帶顯色為陰性，質(zhì)控帶未顯色試驗(yàn)失敗，需重復(fù)檢測(cè)。
（三）炭疽芽胞桿菌抗體膠體金快速檢測(cè)
取炭疽芽胞桿菌抗體膠體金檢測(cè)試劑條，在樣本孔中加入血清樣本50 uL，質(zhì)控帶顯色后1分鐘內(nèi)觀察。質(zhì)控帶和樣本帶同時(shí)顯色判斷為陽(yáng)性，單一質(zhì)控帶顯色為陰性，質(zhì)控帶未顯色試驗(yàn)失敗，需重復(fù)檢測(cè)。
（四）PCR檢測(cè)
1、模板的制備
經(jīng)過處理的樣本、液體樣本、培養(yǎng)后的菌落采用商品化試劑盒提取核酸，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。提取的核酸溶解在TE溶液中。對(duì)培養(yǎng)后菌落可用加熱法快速提取核酸：挑取1-2個(gè)菌落加入EP管中，加入150 μＬ去離子水并混均后100℃處理10 min，12000 rpm離心5分鐘，取上清液作為模板。
2、引物、探針序列如下表所示。
3、PCR 反應(yīng)體系(25μL/份)
4、結(jié)果判斷：
Ct值在15-40之間且陰性對(duì)照成立，判斷為PCR反應(yīng)陽(yáng)性。pagA基因和cap基因陽(yáng)性同時(shí)可判斷為樣本中炭疽芽胞桿菌核酸陽(yáng)性。
（五）分離培養(yǎng)和鑒定
1、樣本接種培養(yǎng)
取經(jīng)過預(yù)處理的樣本、液體樣本少量，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和血瓊脂平板上劃線接種，37℃培養(yǎng)24-48 h。可疑菌落形態(tài)為扁平粗糙，灰白色，干燥，邊緣不整齊；培養(yǎng)20 h以內(nèi)的菌落在低倍鏡下呈卷發(fā)狀；血平板上菌落周圍不產(chǎn)生溶血環(huán)。
2、染色鑒定
取部分可疑菌落涂片，經(jīng)革蘭氏染色，在100倍油鏡下發(fā)現(xiàn)革蘭氏染色陽(yáng)性大桿菌，兩端平齊，長(zhǎng)鏈狀排列，原生質(zhì)相連呈竹節(jié)狀，具有典型卵圓形芽胞，靠近細(xì)胞中央或靠近邊緣，細(xì)胞不膨脹，判斷為炭疽芽胞桿菌。
3、青霉素敏感試驗(yàn)和噬菌體敏感試驗(yàn)
可疑菌落經(jīng)分離純化培養(yǎng)（37℃，24h）后，取純菌均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，平板一側(cè)中央無(wú)菌操作放一片青霉素藥敏紙片（10 U/mL）;另一側(cè)滴加一滴炭疽噬菌體，略傾斜平板使噬菌體流下一段距離。
在37℃下培養(yǎng)24h。觀察藥敏紙片周圍細(xì)菌生長(zhǎng)情況和噬菌斑形成情況。青霉素藥敏紙片周圍無(wú)生長(zhǎng)且形成長(zhǎng)淚滴狀噬菌斑可判斷為炭疽芽胞桿菌陽(yáng)性。
三、生物安全要求
從事樣本檢測(cè)的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)和具備相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技能，在檢測(cè)的過程中樣本檢測(cè)人員必需采取傳染病二級(jí)防護(hù)措施，即佩戴N95醫(yī)用防護(hù)口罩、工作帽、護(hù)目鏡或面屏、雙層醫(yī)用乳膠手套、醫(yī)用連體防護(hù)服、工作鞋和鞋套。
樣本檢測(cè)應(yīng)生物安全二級(jí)（BSL-2）及以上實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。樣本檢測(cè)，包括打開樣本管及檢測(cè)操作等須在二級(jí)及以上生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。提取的核酸樣本可在生物安全一級(jí)（BSL-1）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。大量活菌操作須在生物安全三級(jí)（BSL-3）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。樣本采集過程產(chǎn)生的廢棄物須在現(xiàn)場(chǎng)放入黃色垃圾袋中并密封，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌處理30 min后方可廢棄。檢測(cè)過程產(chǎn)生的廢棄物，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌處理30min方可廢棄。
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來(lái)源：北京疾控